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实验室植物核酸的提取

发布时间:2016-12-16 09:30:17
未来10大赚钱行业_未来十年最赚钱的生意
DNA提取 

样品收集:取新鲜植物叶片(大约250mg)于冻存管中,向管中加入1大4小的钢珠,液氮中冷冻5分钟,之后取出剧烈振摇,待样品被研细后用磁铁将钢珠吸出,样品冻存于-80℃,钢珠用无水乙醇洗涤后用于下一次样品收集。 
 溶液配制: 
溶液 A :100mM Tris 
           100nM NaCl            10mM EDTA 
           1% 十二烷基肌氨酸钠            0.1% NaSO3 
           2%聚乙烯吡咯烷酮 
调节PH至8.5 
溶液B;酚 - 氯仿 - 异戊醇(25:24:1) 溶液C:硅胶基质 
溶液D:3M NaAc(pH4.8) 
溶液E:异丙醇 溶液F:70%的乙醇 
溶液G:含有40ug/ml的TE缓冲液 
        TE缓冲液(10 mMTris, 1 mM EDTA, [pH 8])  步骤: 
1、取出液氮中冻存的样品于2ml离心管中,加入700ul的溶液A,涡旋振荡1分钟 
2、加入700ul 溶液B,800转/分振荡器震荡10分钟。 3、加入500ul溶液C,混匀后3200g离心10分钟。 
4、上层相液体移入1.5ml离心管,加入60ul溶液D和600ul溶液E,涡旋振荡2分钟。 5、3200g离心2分钟。 
6、上清倒出,用500ul溶液F洗涤DNA。 7、离心弃洗液后,干燥DNA。 
8、加入60ul溶液G后于4℃过夜溶解DNA。 

RNA提取 

准备工作(试剂配置和器材准备) 
实验所用的研臼,杵,小药勺,试剂瓶,量筒,剪刀等与实验材料有接触的器皿都要在0.1%的DEPC水中浸泡24h,用锡纸包裹于180℃(烘箱)高温灭菌2h或160℃高温灭菌4h后备用;塑料制品如进口tip头、eppendorf管(1.5ml,0.5ml)高压灭菌,烘干后备用(放置时间不宜超过一周)。RNase-free water的制备如下:在蒸馏水中加入0.1%体积的DEPC原液(如1000ml蒸馏水中加1mlDEPC原液), 用塑料膜封口后,充分混匀,静置过夜,高压灭菌.(注意:DEPC有强诱癌作用,操作时须谨慎,加了DEPC的水放通风橱中,避免吸入气体)  
三、实验操作步骤 
1)称取0.5g植物材料,用液氮速冻后,迅速研磨成细粉,分装于两个1.5ml的eppendorf离心管中 
注意:动作尽量迅速,避免RNA降解;另外,要尽量地选用幼嫩的植物材料,因其RNA的含量相对于老材料要丰富。 2)加入1ml TRIzol,用力摇动使混合均匀,室温下放置5min(混合液呈棕红色,可分成三大层:上层水相中含有RNA,中层含蛋白和下层有机相为材料残渣及DNA等) 
注意:样品的量不要超过TRIzol体积的10%,过多反而会降低RNA的得率。 
3)(此步可根据实际情况选择做还是不做)当样品中蛋白、脂肪及多糖含量较高时,离心(4℃,12,000g,10min), 小心将上清液吸入1.5ml的eppendorf离心管中 
注意:RNA的抽提过程中的所有离心操作皆在4℃的冷冻离心机上进行(下同) 
4)每管加0.2ml氯仿,用力振荡15sec,室温放置2-3min,离心(4℃, 12,000g,15min) 
5)将上清液(约600ul)吸入1.5ml的新eppendorf离心管中,加等体积异丙醇,颠倒混匀(动作要缓和),-20℃冰箱中放置30min(过夜则沉淀更加充分)
 6)离心(4℃,12,000g,15min) 
7)弃上清,收集RNA沉淀,加1ml 75%乙醇洗涤沉淀1-2次(离心4℃,12000g,10-15min,弃上清,收集RNA沉淀) 注意:75%乙醇为无水乙醇和DEPC处理过的蒸馏水所配制
 8)沉淀室温下干燥15-20min 
注意:不应该完全干燥失水,否则RNA沉淀很难溶解
 9)溶于适量(30-50ul)RNase-free water中 
10)(此步可根据实际情况选择做还是不做)若该种植物含有较多多糖,则需在60℃水浴中温浴5min, 离心(4℃,12,000g,10min)吸取上清备用,此即为所需的RNA液 
11)储存在-70℃的超低温冰箱中备用

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